Lettura guidata del saggio n. 26 · Takahashi & Yamanaka 2006 · Cell 126(4):663-676 · DOI 10.1016/j.cell.2006.07.024
Un dubbio che avevo già prima di leggere il documento.
Ti sei mai posto la domanda: perché dopo la guarigione della ferita, ciò che ricresce è una cicatrice e non una pelle completamente nuova?
Quando una porzione di pelle si ferisce, il corpo può solo rattopparla, non è in grado di far ricrescere un tessuto identico. Una volta che una cellula staminale si differenzia in una cellula della pelle, rimane per sempre una cellula della pelle e non può tornare indietro. La differenziazione cellulare è come una strada a senso unico: si può solo andare avanti, non si può tornare indietro.
Questa era la mia concezione più radicata del destino delle cellule prima di leggere questo articolo.
Nel 2006, un team dell’Università di Kyoto in Giappone ha pubblicato un articolo sulla rivista Cell, lungo solo 14 pagine. Ha dimostrato una cosa:il destino delle cellule non è una strada a senso unico. Le cellule della pelle normali hanno bisogno di solo quattro geni attivatori per tornare allo stato embrionale.
Questo è esattamente il ventesimo anniversario della pubblicazione di questo articolo. Sei anni dopo, ha ricevuto il Premio Nobel.
Oggi analizzerò questo articolo per capire cosa è stato fatto, come è stato fatto e cosa significa per voi.
Perché la strada originale non funziona più?
Prima del 2006, gli scienziati sapevano dell’esistenza di una “cellula madre”, le cellule staminali embrionali, in grado di trasformarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo. Queste cellule avevano due straordinarie capacità: potevano moltiplicarsi all’infinito e mantenere la possibilità di trasformarsi in qualsiasi tipo di cellula.
Il problema è che, per prelevare queste cellule staminali, è necessario distruggere l’embrione. Questo comporta controversie etiche e le fonti sono molto limitate. Se i pazienti hanno bisogno di usare le proprie cellule per curarsi, devono affrontare il problema del rigetto: quando le cellule di un’altra persona entrano nel corpo, il sistema immunitario le attacca.
È possibile creare una cellula madre senza utilizzare embrioni, ma utilizzando le normali cellule del paziente?
Questo problema ha afflitto l’intero settore per molti anni. Le prove esistenti indicano due percorsi: uno consiste nell’inserire il nucleo di una cellula adulta in un ovocita (clonazione), l’altro consiste nel far fondere una cellula adulta con una cellula staminale embrionale. Entrambi i percorsi dimostrano una cosa: all’interno delle cellule esiste un meccanismo che può essere “resettato”. Tuttavia, nessuno sa quali fattori guidino questo reset.
Questo è il punto di partenza di questo saggio.
Non è addizione, è sottrazione.
L’idea dei ricercatori è molto semplice.
Poiché alcuni geni sono particolarmente attivi nelle cellule staminali embrionali e mantengono le caratteristiche delle cellule staminali, possiamo chiederci: se inserissimo questi geni nelle cellule normali, potremmo farle tornare a essere cellule staminali?
Hanno prima selezionato 24 geni candidati. Questi 24 geni erano o altamente espressi nelle cellule staminali embrionali o considerati, da studi precedenti, correlati alle caratteristiche delle cellule staminali.
Poi hanno fatto una cosa che ho trovato molto bella:non un’addizione, ma una sottrazione.
Per prima cosa, abbiamo inserito tutti i 24 geni nelle cellule staminali embrionali di topi normali (che potete considerare come le cellule strutturali della pelle) per vedere se potevamo trasformarle in cellule staminali pluripotenti. Risultato: ci siamo riusciti. Ventidue cloni sono sopravvissuti e alcuni di essi sono cresciuti identici alle cellule staminali embrionali: rotonde, con un grande nucleolo e poco citoplasma.
Subito dopo, rimuovere i geni uno per uno per vedere quale di essi rende le cellule incapaci di sopravvivere.
È come un team di 24 persone, in cui ognuno se ne va uno per uno, e si scopre che il progetto crolla dopo che una persona se ne va - quella persona è la chiave.
La bellezza di questo esperimento sta nel fatto che non si chiede “cosa si può aggiungere”, ma “chi è indispensabile per farlo funzionare”.
Dopo diversi round di eliminazione, la risposta è emersa:sono necessari solo quattro fattori - Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc.
Anche con solo tre di questi, le cellule possono sopravvivere, ma non cresceranno come le cellule madri e non potranno trasformarsi in altre cellule. Non può mancare nemmeno uno. Devi ricordare questi quattro nomi una sola volta, in seguito li chiamerò semplicemente “questi quattro interruttori”.
La mia lettura è la seguente: questi quattro interruttori non sono stati scelti a caso. Oct3/4 e Sox2 sono fattori di trascrizione fondamentali per mantenere lo stato “onnicomprensivo” delle cellule staminali embrionali, come già noto prima del 2006. Sorprendentemente, due “aiutanti”, Klf4 e c-Myc, che erano originariamente geni associati ai tumori, sono stati coinvolti nella riprogrammazione cellulare, il che all’epoca era inaspettato.
Prova concreta: le cellule che regrediscono possono davvero trasformarsi in qualsiasi tipo di cellula.
Dichiarare semplicemente che “somigliano” non è sufficiente. Come dimostrare che queste cellule ripristinate hanno effettivamente recuperato la capacità di trasformarsi in varie cellule del corpo?
I ricercatori hanno condotto un esperimento molto semplice: hanno iniettato queste cellule sotto la pelle dei topi.
Come risultato, è cresciuto un tipo speciale di tumore, chiamato teratoma.
Immaginate: un ammasso di tessuto che sviluppa tessuto nervoso, cartilagine e muscoli, tessuti che non hanno alcuna relazione tra loro, a partire da un tubo di cellule della pelle. Se lo si seziona, si scopre che l’ectoderma (nervoso), il mesoderma (cartilagine e muscoli) e l’endoderma (epitelio cilindrico) sono tutti presenti.
Questo tumore non è lo scopo della ricerca, ma un mezzo di verifica. Dimostra una cosa: le cellule riportate indietro hanno davvero recuperato la capacità di “trasformarsi in qualsiasi tipo di cellula”.
Quello che è ancora più interessante è che non hanno usato solo cellule embrionali.
I ricercatori hanno prelevato cellule normali dalla pelle della punta della coda di topi adulti. Non erano embrioni, né cuccioli, ma topi completamente adulti di 7 e 12 settimane. Dopo l’aggiunta degli stessi quattro interruttori, anche queste cellule adulte sono riuscite a tornare indietro. Una volta iniettate negli embrioni di topo, queste cellule hanno partecipato al normale sviluppo embrionale, differenziandosi in tessuti di tutti i germi embrionali.
Anche le cellule degli adulti possono essere riportate indietro.Questa è stata una delle scoperte che mi ha colpito di più in questo articolo.
Il documento riporta inoltre i risultati di un esperimento di ibridazione: in un embrione E7.5, 3 su 22 hanno rilevato la presenza di cellule iPS marcate con la proteina fluorescente verde. In un altro embrione E13.5, 2 su 18 hanno confermato la presenza di cellule iPS. Questi numeri possono sembrare bassi, ma sono molto significativi: dimostrano che le cellule reintrodotte non solo sopravvivono in laboratorio, ma possono anche partecipare ai processi di sviluppo reali.
Tuttavia, dopo la nascita degli ibridi, nessuno dei 27 cuccioli è stato identificato come topo chimerico. La spiegazione fornita nello studio è stata molto onesta: il silenziamento di Oct3/4 nelle cellule iPS non era completo, il che potrebbe essere stato il motivo per cui non è stato possibile ottenere ibridi vivi. Questo tipo di onestà era raro nella ricerca di quel periodo.
Una confessione onesta: è simile, ma non esattamente uguale.
La parte che sto per spiegare è quella che considero la più degna di rispetto di questo saggio.
I ricercatori non hanno affermato che le cellule riportate indietro sono “identiche” alle vere cellule staminali embrionali. Hanno effettuato un confronto del profilo di espressione del genoma completo (analisi di microarray del DNA), i cui risultati sono stati i seguenti:
I due sono simili, ma non completamente uguali.
Nello specifico, alcuni geni sono molto attivi nelle cellule staminali embrionali, ma lo sono molto meno nelle cellule riprogrammate. Lo studio ha suddiviso questi geni in tre gruppi: il primo gruppo è costituito da geni altamente espressi in entrambi i tipi di cellule (come Myb, Kit, Gdf3, Zic3), il secondo gruppo è costituito da geni altamente espressi nelle cellule staminali embrionali e nelle cellule iPS di alta qualità, ma poco espressi nelle cellule iPS di bassa qualità (inclusi Nanog, Sox2, ecc.), mentre il terzo gruppo è costituito da geni altamente espressi solo nelle cellule staminali embrionali (inclusi Dnmt3a, Dnmt3b, ecc.).
Questa distinzione è importante. Ci dice che la riprogrammazione non è una semplice “ripristino delle impostazioni di fabbrica con un solo clic”, ma un processo incompleto e stratificato. Alcuni interruttori genetici vengono ripristinati con successo, mentre altri no.
Un altro problema riguarda il vettore virale. Il retrovirus utilizzato per trasportare questi quattro interruttori lascia circa 20 copie nel genoma cellulare (l’analisi di Southern blot del documento mostra che ogni clone ha circa 20 siti di integrazione). Ciò significa che il DNA della cellula è stato “occupato” da frammenti di geni estranei. Questo è accettabile per la ricerca, ma rappresenta un potenziale rischio per l’applicazione clinica.
C’è un altro dettaglio che potrebbe essere trascurato: queste cellule iPS non possono mantenere il loro stato indifferenziato in assenza di cellule di strato feeder, nemmeno in presenza di LIF. Ciò significa che dipendono maggiormente dall’ambiente di coltura rispetto alle cellule staminali embrionali. Lo studio ha anche evidenziato questo come una differenza tra le cellule iPS e le cellule staminali embrionali.
Questi dettagli determinano i confini di questa tecnologia: cosa ha già funzionato e cosa potrebbe ancora avere dei rischi.
Rischio di cancro: un ostacolo inevitabile
Tra i quattro interruttori, ce n’è uno chiamato c-Myc. Questo è di per sé un gene cancerogeno; nel corpo normale, la funzione del c-Myc è quella di stimolare la crescita e la divisione delle cellule. Se queste diventano troppo attive, si sviluppa il cancro.
Il documento afferma chiaramente: “L’uso di c-Myc potrebbe non essere adatto per applicazioni cliniche”.
Questo avvertimento non è infondato. Lo studio stesso ha riportato che alcuni topi a cui sono state iniettate cellule iPS hanno sviluppato tumori. Nell’esperimento sui teratomi, 5 cloni iPS-MEF10, 3 cloni iPS-MEF4, 1 clone iPS-MEF4wt e 6 cloni iPS-MEF3 sono stati iniettati in topi nudi - tutti i tumori sviluppati dal clone iPS-MEF3 erano costituiti da cellule indifferenziate, senza alcun segno di differenziazione.
L’analisi del meccanismo cancerogeno contenuta nel documento merita di essere letta. La proteina c-Myc si lega al complesso di istone acetiltransferasi (HAT), che include TRRAP, CBP e p300. Nel genoma dei mammiferi, i siti di legame di c-Myc possono arrivare a 25.000, un numero molto superiore rispetto a quello dei siti di legame di Oct3/4 e Sox2. c-Myc potrebbe consentire a Oct3/4 e Sox2 di legarsi ai loro obiettivi specifici attraverso l’acetilazione globale delle istoni. Questa è un’ipotesi di meccanismo molto sofisticata, ma implica anche che l’influenza di c-Myc sia troppo ampia: non si limita ad attivare gli interruttori necessari, ma interviene ovunque.
Il documento discute anche un interessante equilibrio: il Klf4 è in grado di inibire direttamente il p53 (un fattore di soppressione del tumore), mentre il c-Myc è in grado di inibire il p21 (un fattore di soppressione del ciclo cellulare). Questi due fattori potrebbero aver creato un certo equilibrio di reciproca regolazione durante il processo di riprogrammazione; tuttavia, se questo equilibrio venisse interrotto all’interno del corpo, la conseguenza potrebbe essere la formazione di un tumore.
In seguito, i team di ricerca hanno sostituito c-Myc o hanno utilizzato metodi più sicuri per trasportare i geni (come il virus Sendai o i plasmidi anziché i retrovirus). Tuttavia, tali miglioramenti sono stati apportati da team successivi e non costituiscono oggetto di questo articolo; non attribuire i risultati successivi a questo articolo.
Questa è la panoramica generale di questo articolo: ci sono innovazioni e rischi. Entrambi sono stati descritti nello stesso articolo.
Dal saggio al Premio Nobel: cosa significano sei anni?
Questo articolo è stato pubblicato nel 2006 e nel 2012 ha ricevuto il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina.
Sei anni.
Nel mondo accademico, questa velocità equivale praticamente al fatto che tutti abbiano immediatamente compreso quanto fosse importante. Di solito, per il Premio Nobel si aspettano due o tre decenni, in attesa che l’impatto di una scoperta venga pienamente convalidato. Concedere il premio dopo sei anni significa che i giudici ritengono che la sua importanza non richieda ulteriori attese.
Oggi, gli scienziati usano queste cellule riprogrammate per molte cose: per creare modelli della malattia di Parkinson per lo screening dei farmaci, per coltivare cellule della retina per il trattamento della degenerazione maculare. Il Giappone ha già avviato sperimentazioni cliniche per il trattamento delle malattie oculari con queste cellule e in tutto il mondo sono in corso diversi studi clinici.
Fate attenzione alla mia formulazione: è in corso. Non dirò che può curare alcuna malattia o contrastare l’invecchiamento. Tutto ciò è ancora in fase di sperimentazione e non è possibile trarre conclusioni definitive.
L’ “ago per le cellule staminali” che potresti aver visto
A questo punto, potresti aver visto sul mercato un’affermazione: “Aghi anti-invecchiamento con cellule staminali”. Un ago costa decine di migliaia di yuan e si afferma che possa far invecchiare le persone più lentamente e invertire il processo di invecchiamento.
Questo richiede un’analisi più approfondita.
La base scientifica è solida. Questo articolo ne è una prova, e sono inoltre in corso diversi studi clinici. Dal 2006 ad oggi, questo campo si è sviluppato molto rapidamente, con nuovi studi clinici avviati uno dopo l’altro.
Tuttavia, alcuni prodotti sul mercato affermano di trasformare una “tecnologia ancora in fase di ricerca” in una “soluzione antinvecchiamento già collaudata”. Queste due cose sono diverse. Il fatto che una ricerca sia promettente non significa che sia già stata dimostrata efficace.
Non posso fornire consigli medici su nessun marchio o terapia. Quello che devi fare è distinguere tra ciò che è scienza solida e ciò che è marketing ben confezionato.
Alcuni punti che vale la pena ricordare
Dopo aver letto questo saggio, ci sono alcuni punti che vorrei sottolineare in particolare.
In primo luogo, l’efficienza della riprogrammazione è estremamente bassa.Gli autori ammettono che solo una piccola parte delle cellule che esprimono i quattro fattori si è trasformata in cellule iPS. Hanno proposto diverse possibili spiegazioni: il livello di espressione dei quattro fattori deve rientrare in un intervallo preciso (gli autori citano un dato secondo cui un aumento o una diminuzione del 50% del livello di proteine Oct3/4 provocherebbe la differenziazione delle cellule staminali embrionali); potrebbero essere necessarie ulteriori alterazioni cromosomiche; oppure potrebbe essere che l’inserimento casuale di un retrovirus abbia attivato il giusto insieme di geni in alcuni cloni. Ad oggi, il problema dell’efficienza rimane una sfida fondamentale in questo campo.
In secondo luogo, la questione della fonte delle cellule iPS non è stata ancora risolta.Il documento discute una possibilità: le cellule iPS potrebbero non essere state riprogrammate direttamente dalle fibroblasti, ma trasformate da un piccolo numero di cellule staminali tissutali già presenti nella coltura (si stima che lo 0,067% delle cellule della pelle siano cellule staminali). Tuttavia, gli autori hanno fornito una confutazione: l’efficienza di induzione delle cellule iPS a partire da matrici ossee (che dovrebbero contenere un maggior numero di cellule staminali mesenchimali) è altrettanto bassa e le cellule indotte con tre fattori non mostrano alcuna pluripotenza. Queste evidenze non supportano l’ipotesi che “le cellule staminali tissutali siano la fonte delle cellule iPS”, ma non forniscono neanche una risposta definitiva.
In terzo luogo, esiste una sottile interdipendenza tra i quattro fattori.c-Myc promuove la proliferazione, Klf4 inibisce p53, ma attiva anche p21 (un inibitore del ciclo cellulare), mentre c-Myc a sua volta inibisce p21. Secondo lo studio, “l’equilibrio tra c-Myc e Klf4 potrebbe essere importante per la generazione di cellule iPS” - questi quattro fattori non funzionano in modo indipendente, ma interagiscono in modo complesso. Questa scoperta ha fornito un utile spunto per migliorare i metodi di riprogrammazione in futuro.
In quarto luogo, il documento menziona una direzione finale:Hanno scoperto che il sistema di segnalazione del gene Nanog poteva essere utilizzato per sostituire Fbx15 nello screening. Ciò significa che a quel punto avevano già un’idea di come migliorare il metodo di screening, utilizzando standard di screening più rigorosi, che potevano fornire cellule iPS di qualità superiore. Gli studi successivi hanno effettivamente percorso una lunga strada in questa direzione.
Ricorda solo tre cose
Ti ricordi la domanda iniziale? Perché una ferita può solo lasciare una cicatrice e non può rigenerare la pelle completamente?
Perché la differenziazione cellulare è a senso unico - almeno fino al 2006 è quello che pensavamo.
Questo articolo di 14 pagine dimostra chequattro interruttori sono sufficienti per ripristinare le impostazioni di fabbrica delle cellule cutanee normali.Non si tratta di una metafora, ma di un dato sperimentale.
In primo luogo, il destino delle cellule non è irreversibile. Quattro interruttori genetici sono sufficienti per far tornare le cellule mature allo stato embrionale.
In secondo luogo, non si tratta di fantascienza. Sono in corso sperimentazioni cliniche basate sulle cellule iPS e, sebbene non si tratti ancora di una terapia matura, la direzione è chiara.
In terzo luogo, non tutte le “cellule staminali” sono uguali. C’è una netta differenza tra quanto viene pubblicizzato sul mercato e i fatti scientifici.
Siamo il tipo di persone che leggono i documenti fino alla fine. Se anche tu vuoi sapere come questi quattro interruttori siano finiti in ospedale, clicca su “Segui” e continua a leggere nel prossimo episodio.
- Riferimenti * *
Takahashi, K. & Yamanaka, S. (2006). Induzione di cellule staminali pluripotenti da colture di fibroblasti embrionali e adulti di topo mediante fattori definiti. Cell, 126(4), 663-676. DOI: 10.1016/j.cell.2006.07.024
