論文の読み合わせ第26回・高橋・山中 2006年・Cell 126(4):663-676・DOI 10.1016/j.cell.2006.07.024
論文を読む前から持っていた疑問
あなたはこの疑問を考えたことはありますか？なぜ傷が治った後に傷痕が残るのか、そして全く新しい肌にならないのか？
肌が傷つくと、体は元の組織を再生できず、代わりにパッチを当てるしかありません。幹細胞が肌細胞に分化した後、それは永久に肌細胞のままで、元に戻ることはありません。細胞分化は一方通行の道のようで、前に進むしかなく、後に戻ることはできません。
この論文を読む前に、私が持っていた細胞の運命についての最も根深い認識はこれでした。
2006年に京都大学のチームが「セル」誌に14ページの論文を発表しました。その論文では、細胞の運命は一筋道ではないことを証明しました。普通の皮膚細胞は、わずか4つの遺伝子スイッチを操作するだけで、胚の状態に戻ることができるのです。
今年はこの論文の発表から20年目です。6年後にノーベル賞を受賞しました。
今日はこの論文を分析し、何が行われていたのか、どのように行われていたのか、そしてあなたにとって何を意味するのかを見ていきましょう。
なぜ元の道は通れなかったのか
2006年以前に、科学者たちは体のどの細胞にも変化することができる「マザーセル」、つまり胚性幹細胞の存在を発見していました。この細胞は、無限に増殖しながら、どんな細胞にも変化する潜在的な能力を持っていたのです。
問題は、このような母細胞を抽出するには胚を破壊しなければならないということです。これは倫理的な議論を引き起こし、供給源も非常に限られています。患者が自分の細胞で治療を受けたい場合、免疫システムが他の細胞を攻撃するため、拒絶反応という問題に直面しなければなりません。
胚を使わなくても、患者自身の普通の細胞から母細胞を作ることはできるのでしょうか？
この問題は何年も前からこの分野全体で議論されてきました。現在までの証拠は、2つのアプローチを示しています。1つは成体細胞の核を卵細胞に移植する（クローニング）、もう1つは成体細胞と胚性幹細胞を融合させることです。いずれのアプローチも、細胞に「リセット」できる何らかのメカニズムが存在することを示しています。しかし、この「リセット」を促す因子が何なのかはまだわかっていません。
この論文の切り口はここにあるのです。
それは足し算ではなく、引き算です
研究者たちの考え方は非常にシンプルです。
胚性幹細胞には母細胞の特性を維持するための特定の遺伝子が活発に発現しているため、その逆を考えてみましょう。これらの遺伝子を通常の細胞に導入すれば、それらが母細胞に戻るのではないでしょうか？
まず、彼らは24の候補遺伝子を選びました。これらの遺伝子は、胚性幹細胞で高発現しているか、すでに行われている研究で幹細胞の特性と関連付けられているものでした。
そして、彼らは私がとても美しいと思うことをしました。それは足し算ではなく、引き算でした。
まず、24の遺伝子をすべて通常のマウス胚線維芽細胞（皮膚の構造細胞と考えることができます）に導入し、それらが母細胞になるかどうかを確認しました。結果：可能でした。22のクローンが生存し、その一部は胚幹細胞と全く同じように成長しました。丸く、大核で細胞質がわずかでした。
次に、遺伝子を一つずつ取り除き、どの遺伝子を取り除いた後に細胞が生存できなくなるかを確認していきましょう。
24人のチームのように、1人ずつ送り出し、誰が去った後にプロジェクトが崩れそうになったら、その人がキーパーソンなのです。
この実験の美しさは、「何を足せばいいのか」ではなく、「誰がいなければいけないのか」という問いに答えている点にあります。
何度かの選択を経て、答えが明らかになりました。たった4つの因子が必要なのです。Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycです。
たった3つだけでも細胞は生きていけますが、母細胞のように成長することも、他の細胞に変化することもありません。1つでも足りません。この4つの名前は1度だけ覚えておけばいいです、後で私は「この4つのスイッチ」と呼ぶことにします。
私の読み方は次の通りです。この4つのスイッチはランダムに選ばれたわけではありません。Oct3/4とSox2は、胚性幹細胞が「万能」な状態を維持するための中心的な転写因子であり、2006年以前からすでにそのことがわかっていました。しかし、意外なことに、Klf4とc-Mycという2つの「ヘルパー」遺伝子が関与しており、これらは当初は腫瘍関連遺伝子と考えられていました。癌遺伝子が細胞の再プログラミングに関与しているという事実は、当時の私たちにとって予想外のものでした。
確かな証拠：後方に移動した細胞は本当にどんな細胞にも変わることができるのか？
「似ている」と言うだけでは不十分です。これらの逆行き細胞が本当に「全身のさまざまな細胞に変化する」という能力を取り戻したことをどうやって証明するのでしょうか？
研究者たちは、これらの細胞をマウスの皮膚の下に注射するという非常に直接的な実験を行っています。
その結果、特定の種類の腫瘍（テルモラ）が発生しました。
想像してみてください。肉の塊から神経組織、軟骨、筋肉が生えているのです。これらの組織は本来は関係がないはずなのに、皮膚細胞から作られています。切ってみると、外胚層（神経）、中胚層（軟骨と筋肉）、内胚層（柱状上皮）がすべてそこにあります。
この腫瘍は研究の目的ではなく、検証の手段です。これは一つのことを証明しています。つまり、逆行した細胞は、本当に「どんな細胞にも変化する」という能力を取り戻しているのです。
さらに興味深いのは、彼らが使っていたのは胚細胞だけではないということです。
研究者たちは、成長したマウスの尾の先から普通の皮膚細胞を抽出しました。これらのマウスは胎児ではなく、生後7週間と12週間の完全に成長したマウスでした。同じ4つのスイッチを追加した後、これらの成長した細胞も正常に逆行しました。マウスの胚に注入された後、これらの細胞は正常な胚の発達に関与し、各胚葉の組織に分化しました。
大人の細胞も元に戻せるのです。これはこの論文で最も私を感動させた発見の1つでした。
論文では、嵌合実験の結果も報告されています。E7.5胚のうち22個の胚から、緑色蛍光タンパク質で標識されたiPS細胞が検出されました。また、E13.5胚の18個のうち2個では、iPS細胞が関与していることが確認されました。これらの数字は低いように見えますが、非常に意味深いものです。これは、逆行きの細胞が実験室で生存しているだけでなく、実際の発達過程に関与していることを証明しています。
しかし、嵌合体が生まれても、27頭の子供のうち嵌合体マウスと確認されたのは1頭もありませんでした。論文では、Oct3/4がiPS細胞で完全には沈黙しなかったため、生体の嵌合体を得ることができなかった可能性を率直に説明しています。このような率直な説明は、当時の研究では珍しいものでした。
正直に言うと、似ているけれども全く同じではない。
次に私がお話しするのは、この論文が最も尊敬に値すると思う部分です。
研究者たちは、後方に移動した細胞が本物の胚性幹細胞と「全く同じ」ものであるとは主張していません。彼らは、全ゲノムの発現プロファイル（DNAマイクロアレイ分析）を比較し、次のような結果を得ました。:
両者は似ていますが、完全には同じではありません。**
具体的には、一部の遺伝子は胚性幹細胞で高発現し、逆転細胞では低発現となっています。本研究では、これらの遺伝子を3つのグループに分類しました。第1グループは、Myb、Kit、Gdf3、Zic3など、両方で高発現の遺伝子です。第2グループは、Nanog、Sox2など、胚性幹細胞と高品質のiPS細胞で高発現、低品質のiPS細胞で低発現の遺伝子です。第3グループは、Dnmt3a、Dnmt3bなど、胚性幹細胞でしか高発現していない遺伝子です。
この区別は非常に重要です。これは、再プログラミングが「工場出荷時の設定に戻す」という単純なものではなく、不完全かつ段階的なプロセスであることを示しています。一部の遺伝子スイッチが正常にリセットされたのに対し、他のスイッチはまだリセットされていないのです。
もう1つの問題はウイルスベクターです。この4つのスイッチを運ぶ逆転写ウイルスは、細胞のゲノムに約20コピーを残します（論文のサザンブロット分析では、各クローンに約20個の統合部位が示されています）。これは、細胞のDNAが外来の遺伝子断片によって「占領」されたことを意味します。研究には問題ではないものの、臨床応用には潜在的なリスクとなります。
また、見過ごされがちな細かい点が1つあります。それは、これらのiPS細胞は、LIFがあっても、培養層細胞がなければ未分化の状態を維持できないということです。つまり、iPS細胞は胚性幹細胞よりも培養環境に依存しているのです。論文では、これもiPS細胞と胚性幹細胞の違いとして挙げています。
これらの詳細な点によって、この技術の限界がどこにあるのか、すでに実用化されているのか、まだリスクがあるのかが決まってきます。
癌のリスク：避けられない問題
4つのスイッチのうちの1つはc-Mycと呼ばれています。これ自体が発癌遺伝子であり、正常な体内では細胞の成長と分裂を促進する役割を果たしています。しかし、この遺伝子が過剰に発現すると、癌の発症につながる可能性があります。
論文では明確に書かれています。「c-Mycの使用は臨床応用には適していない可能性がある」（c-Mycは臨床応用に適していない可能性がある）。
この警告は根拠のないものではない。論文自体で、注射されたiPS細胞を受けたマウスに腫瘍が発生したことが報告されています。異形腫実験では、5つのiPS-MEF10クローン、3つのiPS-MEF4クローン、1つのiPS-MEF4wtクローン、6つのiPS-MEF3クローンが裸のマウスに注射されました。その結果、iPS-MEF3クローンから生じた腫瘍はすべて未分化細胞で構成され、分化の兆候は全く見られませんでした。
この論文では、癌の発生メカニズムについての分析も興味深いものです。c-Mycタンパク質は、TRRAP、CBP、p300を含むヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）複合体と結合します。哺乳類のゲノムでは、c-Mycの結合部位は25,000か所ある可能性があります。これは、Oct3/4やSox2の結合部位の数をはるかに上回るものです。c-Mycは、ヒストンのアセチル化を介して、Oct3/4やSox2がそれぞれの標的遺伝子に結合するのを可能にするかもしれません。これは非常に精巧なメカニズムですが、c-Mycの影響範囲が広すぎることを意味します。c-Mycは必要なスイッチをオンにするだけでなく、あらゆる場所で活性化しているのです。
論文では、Klf4がp53（腫瘍抑制因子）を直接抑制し、c-Mycがp21（細胞周期抑制因子）を抑制するという興味深いバランス関係についても議論しています。これら2つの因子は、再プログラミングの過程で何らかの相互抑制のバランスを形成している可能性がありますが、体内でこのバランスが崩れれば、それは腫瘍の発生につながる可能性があります。
後の研究チームは、c-Mycを置き換えたり、より安全な遺伝子送達方法（逆転写ウイルスではなく仙台ウイルスやプラスミドを使用するなど）に切り替えたりしました。しかし、これらの改良は後のチームによるもので、この論文の内容ではないのです。後の成果をこの論文に帰属させないでください。
この論文の全容はこれだ。画期的な発見とリスクが両方ともに同じ論文に書かれています。
論文からノーベル賞まで：6年間が何を意味するか
この論文は2006年に発表され、2012年にノーベル生理学・医学賞を受賞しました。
6年間。
学術界では、この速度はほとんど全員がその重要性を即座に理解することを意味します。ノーベル賞は、通常、発見の影響が十分に検証されるまで20～30年待たなければなりませんが、6年で授与されたことは、審査員がこの事象の意義をさらに待つ必要はないと判断したことを示しています。
現在、科学者たちはこのような逆行き細胞を使ってさまざまなことを行っています。パーキンソン病のモデルを作成して薬剤を選別したり、黄斑変性症の治療に網膜細胞を培養したりです。日本ではすでにこのような細胞を使った眼科疾患の治療のための臨床試験が実施されており、世界各国でも複数の試験が進行中です。
私の言葉に注意してください。進行中です。私はそれがどのような病気を治すことができるか、老化と戦うことができるかは言えません。それらはいずれも実験段階にあり、結論を出すことはできません。
あなたが見たことがあるかもしれない「幹細胞針」
この点については、市場で「幹細胞抗老化注射」という製品を見たことがあるかもしれません。1回の注射で数万円するもので、若返りや老化防止を約束するものです。
ここでは少し注意が必要です。
科学的根拠は確かなものです。この論文はその証拠の1つであり、複数の臨床試験が進行中です。2006年から現在までに、この分野は非常に急速に発展しており、新しい臨床試験が次々と開始されています。
しかし、市場には「まだ研究段階の技術」を「すでに実証された抗老化ソリューション」として宣伝している製品もあります。これらは別物です。研究に希望があるからといって効果が実証されたわけではないのです。
私はどのブランドや治療法についても医療的なアドバイスを提供することはできません。あなたにして欲しいことは、何が確かな科学で何が宣伝されたマーケティングなのかを見極めることです。
注意すべき点がいくつかあります
この論文を読み終わった後、いくつか特に言いたい点があります。
第一に、再プログラミングの効率が非常に低い。論文自体でも、4つの因子を発現させた細胞のうちiPS細胞になるのはごく少数だと認めています。いくつもの可能性が示されていますが、4つの因子の発現レベルが特定の範囲に収まる必要がある（論文ではOct3/4タンパク質のレベルが50%増加または減少すると、胚性幹細胞が分化すると述べられています）、追加の染色体変化が必要かもしれない、またはレトロウイルスのランダムな挿入によって特定のクローンで適切な遺伝子組み合わせが活性化された可能性もあります。今日では、効率の問題がこの分野の中心的な課題の1つとして残っています。
第二に、iPS細胞の起源については決定的な結論が出ていない。論文では、iPS細胞が線維芽細胞から直接再プログラムされるのではなく、培地にすでに存在する少数の組織幹細胞から変化する可能性が議論されています（皮膚細胞の約0.067%が幹細胞であることがわかっています）。しかし、反論もあります。骨髄基質（より多くの間葉系幹細胞が含まれるはず）からiPSを誘導する効率は同様に低く、3因子誘導細胞は全く多能ではないのです。これらの証拠は、「組織幹細胞がiPSの起源である」という仮説を支持するものではありませんが、確かな答えを提供するものでもありません。
第三に、4つの因子間には微妙な相互制約があります。c-Mycは増殖を促進し、Klf4はp53を抑制しながらp21（細胞周期抑制因子）を活性化し、一方でc-Mycはp21を抑制します。論文では「c-MycとKlf4のバランスがiPS細胞の生成に重要である可能性がある」と主張しており、これら4つのスイッチはそれぞれ独立して機能するのではなく、複雑な相互作用を示しています。この知見は、後に再プログラミングの手法を改善するうえで非常に有益なものでした。
四つ目に、論文の最後には次のような方向性が示されています。彼らは、Fbx15の代わりにNanog遺伝子の報告系を用いてスクリーニングを実施できることを発見しました。つまり、彼らは当時すでにスクリーニング方法を改善するためのアイデアを持っていたのです。より厳しいスクリーニング基準を用いることで、より高品質のiPS細胞が得られる可能性があると考えていたのです。後の研究では、この方向性に沿って大きな進歩が遂げられてきました。
たった3つのことを覚えておけばいいよ。
冒頭の質問を覚えている？なぜ傷は完璧な肌を再生するのではなく、ただ傷跡になるの？
細胞の分化は一方向の道であると考えられていましたが、少なくとも2006年までそう考えていました。
14ページの論文では、4つのスイッチで普通の皮膚細胞を工場出荷時の状態に復元できることを証明しています。これは比喩ではなく、実験による事実です。
まず、細胞の運命は一方向ではないのです。4つの遺伝子スイッチで成熟した細胞を胚の状態に戻すことができます。
第二に、これはSFではない。iPS細胞をベースにした臨床試験が進行中であり、まだ完全な治療法ではないものの、方向性は明確である。
第三に、すべての「幹細胞」が同じではないのです。市場の宣伝と科学的事実の間には、明確な違いがあります。
私たちは、論文を最後まで読み切るタイプです。もしあなたもこの4つのスイッチが後にどのようにして病院に導入されたのか知りたければ、フォローをお願いします。次回のエピソードで続きます。
参考文献
高橋 健一郎、山中 伸一郎（2006年）。「定義された因子によるマウス胚性および成体線維芽細胞培養物からの多能性幹細胞の誘導」。Cell 126(4)、663～676。DOI: 10.1016/j.cell.2006.07.024
